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Wann sollte ich meine UHPLC als UHPLC betreiben?
S. Kromidas
Moderne analytische LC-Anlagen sind ausnahmslos als UHPLC-Anlagen konzipiert. Allerdings werden außerhalb von reinen Forschungslabors höchstens ca. 30–40% der Trennungen an UHPLC-Anlagen unter UHPLC-Bedingungen durchgeführt. Damit sind Drücke oberhalb ca. 800 bar gemeint. In welchen Fällen ist es nun sinnvoll oder sogar notwendig, die vorhandene UHPLC-Anlage tatsächlich unter UHPLC-Bedingungen zu betreiben? Und in welchen Fällen sollte man dagegen die UHPLC-Anlage möglicherweise eher im „klassischen“ HPLC-Modus oder lediglich für schnelle HPLC-Trennungen einsetzen? Und: Sollte die nächste LC-Anlage vielleicht doch wieder eine HPLC werden? Genau um solche Entscheidungen geht es in diesem Kapitel. Dazu hilft die Beantwortung zweier Fragen, mit denen wir uns beschäftigen werden. Die erste lautet: „Was benötige ich eigentlich?“ Dabei gilt es zu definieren, welche Charakteristika einer HPLC-Methode in genau dieser Situation im Vordergrund stehen, z. B.: kurze Retentionszeiten, zuverlässige Methode, maximale Auflösung/Peakkapazität, niedrige Nachweisgrenze u. Ä. Die zweite Frage ist wesentlich einfacher: „Was vermag die UHPLC mehr als die HPLC?“ Anschließend werden wir die Kernfrage diskutieren: „Wie bringe ich meine Anforderungen an die Methode unter Berücksichtigung der realen Laborsituation mit dem Potenzial der UHPLC sinnvoll zusammen?“ Bemerkung: Theoretische Hintergründe werden vorausgesetzt, die Prinzipien der HPLC-Optimierung lediglich genannt, jedoch nicht hergeleitet. Hier wird auf die entsprechende Literatur verwiesen (z. B. [1–5]).
1.1 Was möchte ich erreichen und was „kann“ die UHPLC?
Was möchte ich erreichen?
Für eine HPLC-Methode wünscht man sich oft mehr als nur ein Attribut, z. B.: „gute“ und „schnelle“ Trennung. Es sind jedoch vor der Entscheidung für das Methodendesign – die ja auch die Frage nach der Notwendigkeit von UHPLC-Bedingungen beinhaltet – dringend zwei Punkte zu klären. Erstens: Welche sind die Eigenarten der Methode, ferner wie ist das Umfeld? Es geht demnach u. a. um folgende entscheidenden Merkmale: mögliche Belastung der Probe mit Matrix, notwendige Zeit für die Probenvorbereitung oder die manuelle Integration, Erfahrung der Anwender, wechselnde oder gleichbleibende chromatographische Bedingungen, Forschungs- oder Routinelabor etc.? Zweitens: Was ist im konkreten Fall die primäre Anforderung an diese Methode? Das Hauptziel sollte klar identifiziert, ein zweites ggf. ein drittes lediglich als Wunsch angesehen werden, z. B.: „In diesem Fall brauchen wir aus diesem Grund unbedingt maximal mögliche Empfindlichkeit – wenn die Methode dabei auch robust ist, wäre es schön …“ Nachfolgend sind vier typische Anforderungen an eine HPLC-Methode aufgeführt, die wir anschließend genauer betrachten werden:
- Gut trennen; das kann zum einen ausreichende Auflösung bedeuten – d. h. Trennung zwischen zwei Peaks, evtl. Trennung von 2–3 relevanten/kritischen Peakpaaren. Oder zum anderen ausreichende Peakkapazität, d. h. Trennung von vielen – allen(?) – evtl. chemisch ähnlichen Komponenten, also möglichst viele Peaks pro Zeiteinheit, s. Abschnitt 1.2.1
- Schnell trennen; kurze Retentionszeiten, damit geht häufig auch ein geringer Lösemittelverbrauch einher, s. Abschnitt 1.2.2
- Empfindlich messen; Abnahme der Nachweisgrenze, d. h. Verbesserung der relativen Massenempfindlichkeit, s. Abschnitt 1.2.3
- Robuste Bedingungen; zuverlässige Methoden, welche zu einer Vermeidung von Wiederholmessungen und zur Minimierung von Geräteausfallzeiten führen, s. Abschnitt 1.2.4.
Was „kann“ die UHPLC?
Vereinfacht gesagt ist eine UHPLC-Anlage ein Gerät, welches erstens im Vergleich zu einem HPLC-Gerät ein ca. 10-mal geringeres Totvolumen (Dispersionsvolumen, „Extra Column Volume“: Volumen vom Autosampler bis zum Detektor ohne Säule) bzw. Verweilvolumen (Verzögerungsvolumen, „Dwell oder „Delay Volume“: Volumen von Mischventil/Mischkammer bis zum Säulenkopf) aufweist. Das Totvolumen einer modernen UHPLC-Anlage beträgt heute ≤ ca. 7–10 μL – mithilfe spezieller Kits sogar ≤ ca. 4 μL –, die Verweilvolumina betragen ca. 100–200 μL bei Niederdruck- (NDG) und ca. 35–50 μL bei Hochdruckgradienten (HDG).
Bemerkung: Statt von „Extra Column Volume“ ist immer häufiger die Rede von „Extra Column Dispersion“. Damit wird dem Umstand Rechnung getragen, dass die Geometrie z. B. von Verbindungen/Mischventilen und somit das Strömungsprofil für die Peakverbreiterung wichtiger als das absolute Totvolumen ist, s. dazu detaillierte Ausführungen in Abschnitt 2.1 und Kapitel 3.
Zweitens erlaubt eine moderne UHPLC-Anlage Arbeitsdrücke bis ca. 1500 bar.
1.2 Anforderungen an eine HPLC-Methode
1.2.1 Gut trennen
Zunächst soll in Kürze dargelegt werden, wie die Trennung in der HPLC prinzipiell verbessert werden kann, anschließend werden wir schauen, welchen Beitrag die UHPLC hinsichtlich einer besseren Trennung leisten kann.
In der HPLC unterscheiden wir bezüglich der Güte einer Trennung zwei Fälle:
- Mich interessieren im Wesentlichen nur eine oder einige Komponenten. Es geht somit um die nach meinen individuellen Kriterien ausreichende Trennung zwischen der besagten Komponente und einer „Störkomponente“ – also letzten Endes um die Trennung zweier Peaks. Im Fokus kann das kritische Paar sein (z. B. Haupt-/Nebenkomponente), möglicherweise auch 2–3 weitere Peakpaare. Das Kriterium hier ist die Auflösung, sie stellt vereinfacht den Abstand zwischen den Peaks an der Basislinie dar.
Mit: R: Auflösung, N: Bodenzahl, grundsätzlich für isokratische Bedingungen definiert, α: Trennfaktor (früher: Selektivitätsfaktor), k: Retentionsfaktor (früher: Kapazitätsfaktor, k′).
- Ich will/muss „alle“ vorhandenen Peaks genügend gut trennen, d. h. möglichst basisliniengetrennt. In diesem Fall kommt die Peakkapazität ins Spiel: Dies ist die Gesamtanzahl der Peaks, die ich mit einer genügend guten Auflösung (z. B. R = 1) in einer bestimmten Zeit trennen kann. Oft wird als Maß für die Peakkapazität die Summe aller Auflösungen angegeben. In der Literatur finden sich mehrere Formeln für die Peakkapazität, betrachten wir hier die zwei einfachsten:
Mit: nc: Peakkapazität, tR1: Retentionszeit des letzten Peaks, tRe: Retentionszeit des ersten Peaks, tG: Gradientendauer, w: Peakbreite an der Peakbasis. Bemerkung: Circa 70–80% der Trennungen sind heute Gradiententrennungen; somit ist die HPLC/UHPLC-Anlage von heute ein Hochdruck- oder ein Niederdruckgradient mit DAD und/oder MS/MS,ferner werdenimmer häufiger Aerosoldetektoren verwendet. Die hier vorgestellten überlegungen gelten prinzipiell sowohl für isokratische als auch für Gradiententrennungen, dennoch werde ich aus eben dargelegtem Grund den Fokus etwas mehr auf Gradiententrennungen legen.
Betrachten wir zunächst die Auflösung:
Gleichung 1.1 kann man entnehmen, dass die Auflösung durch Zunahme des Effizienz-, Retentions- und des Selektivitätsterms verbessert werden kann. Bezüglich des Retentionsterms lautet die Forderung: stärkere Wechselwirkungen, wobei der optimale Wert bei ca. k ≈ 3—5 liegt, d. h. die interessierenden Peaks sollten bei/nach ca. der 3 bis 5-fachen Tot- oder Mobilzeit eluieren. Aus Gl. (1.1) ist ersichtlich, dass der Selektivitätsterm und damit der Trennfaktor α mit Abstand die empfindlichste Funktion für die Auflösung darstellt: (α — 1)/α! Die Bodenzahl dagegen steht unter der Wurzel, eine Verdoppelung von N führte zu einer Verbesserung der Auflösung „nur“ um Faktor ca. 1,4. Zwei Zahlenbeispiele sollen dies veranschaulichen, für eine detaillierte Diskussion, s. [6]:
- Gesetzt den Fall, zwei Peaks eluieren mit einem α-Wert von 1,01. Um diese zwei Peaks basisliniengetrennt zu trennen, benötigte man ca. 160 000 Böden. Gelingt es den α-Wert von 1,01 auf 1,10 zu erhöhen, benötigte man für die gleiche Auflösung lediglich knapp 2000 Böden. Auch eine gering anmutende Verbesserung des α-Wertes von 1,01 auf 1,05 führte dazu, dass man statt 160 000 Böden nun ca. 6000 Böden benötigte.
- Gesetzt ferner den Fall, es liegt eine Trennung mit folgenden Werten vor: k = 2, α = 1,05 und N = 9000. Es ergibt sich eine Auflösung von R = 0,75. Das ist ungenügend, die Auflösung sollte auf R ≥ 1,00 verbessert werden (bei R = 1, überlappung der beiden Peaks von...
