Textprobe: Kapitel 1.3, Grundlagen zur Analyse chloroplastidärer Proteinkomplexe: Chlorophyll und die anderen Pigmente sind proteingebunden und können nur als Protein-Chlorophyll (bzw. Protein-Pigment)-Komplexe aktiv sein. Das Studium der Proteine, die für die Photosynthese essentiell sind, setzte erst sehr spät ein. Die Ursache dafür liegt darin, dass es sich durchweg um membrangebundene Proteine handelt, deren Isolierung und Charakterisierung mit den klassischen Methoden der Proteinanalyse kaum oder gar nicht gelang. Die chromatographisch aufgetrennten - und somit isolierten - Pigmente sind für sich alleine genommen für die Photosynthese wertlos. Die Pigment-Protein-Komplexe, die meisten Proteine der Elektronentransportketten sowie die ATP-Synthetase, sind integrale Bestandteile der Thylakoidmembran Die Positionen in der Membran, und die relative Anordnung der Proteine zueinander sind die wichtigsten Voraussetzungen für die Energieumwandlung. Erst nach Entwicklung empfindlicher Verfahren, wie der Gelelektrophorese und dem kontrollierten Einsatz von Detergentien (z.B. Natriumdodecylsulfat: SDS), wurde es möglich, die Proteine aufzutrennen und zumindest als Banden in einem Gel zu identifizieren. Weiterhin können durch dieses Analyseverfahren die Molekulargewichte der jeweiligen Polypeptidketten bestimmt werden. Ein zweiter, hiervon unabhängiger Ansatz ist die Verwendung spezifischer Sonden, z.B. fluoreszenzmarkierter Antikörper. Durch Einsatz der Gefrierätztechnik ist es so möglich, zu entscheiden, ob ein bestimmtes Protein oder ein Teil einer Polypeptidkette an der Innen- oder der Außenseite einer Membran exponiert ist. Mit Antikörpern gegen bestimmte Proteine gelingt es, das betreffende Protein aus einem Proteingemisch selektiv auszufällen, weil nur dieses den hochspezifischen Antigen-Antikörper-Komplex ausbilden kann. Die Gelelektrophorese ist ein biochemisches Trennverfahren, bei der die Wanderung von geladenen Molekülen in einem elektrischen Feld zu deren Trennung ausgenutzt wird. Elektrophorese von Proteinen wird in einer elektrisch neutralen, festen Gelmatrix aus Polyacrylamid durchgeführt. Die aufgetrennten Proteine erscheinen nach der Elektrophorese und ihrer Färbung als Banden. Das Wanderungsverhalten von Proteinen in den Gelen hängt von der Stärke des angelegten elektrischen Feldes, Größe und Form der Proteine sowie der Ionenstärke, der Porengröße und der Temperatur des Gels ab. Die Gele wirken aufgrund ihrer Porengröße wie Molekularsiebe,welche die Wanderung größerer Proteine verlangsamen oder vollständig blockieren, während kleinere Proteine ungehindert durch die Matrix wandern. Die Porengröße bei Acrylamidgelen wird von der Acrylamidkonzentration und vom Vernetzungsgrad bestimmt der durch die Bisacrylamidkonzentration im Gel festgelegt wird. Die Zusammensetzung des Gels aus Acrylamid und Bisacrylamid wird mit den Parametern T und C in Prozent angegeben. Dabei steht der T- Wert für die Konzentrationen an Acrylamid und Bisacrylamid. Der C Wert gibt das Verhältnis von Bisacrylamid zur Gesamtmenge von Acrylamid und Bisacrylamid an. Die Polymerisation wird durch freie Radikale gestartet, normalerweise durch das APS/TEMEDSystem. APS (Ammoniumpersulfat) zerfällt in wässriger Lösung spontan in ein Persulfatradikal, welches TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin) aktiviert. Dieses wiederum aktiviert die Monomere, in- dem es ein Elektron überträgt. Eine Verbesserung der Auflösung der Proteinbanden kann durch Verwendung von sog. Gradientengelen erreicht werden, bei denen sich die Porengröße innerhalb der Gelmatrix linear oder exponentiell verändert. Ein Problem ist, dass die Proben ein merkliches Volumen haben und infolge der apparativen Gegebenheiten die aufgetragenen Zonen durch ihre Breite die hohe Auflösung vermindern. Das kann durch Verwendung von diskontinuierlichen Elektrophoresen verhindert werden. Dabei besteht das Polyacrylamidgel aus zwei Gelen unterschiedlicher Konzentration und unterschiedlicher Pufferung. Eine diskontinuierliche Elektrophorese kann die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDSPAGE) sein. Die Proteine werden hierbei in Gegenwart eines Überschusses von Natriumdodecylsulfat (SDS) elektrophoretisch aufgetrennt. Das negativ geladene SDS lagert sich an die Proteine an und bringt soviel Ladung mit, dass die Eigenladungen der Proteine keine Rolle mehr spielen und alle Proteine zur Anode wandern. Gleichzeitig werden die Proteine denaturiert und wandern im Gel daher entsprechend ihres Molekulargewichtes. Die Wanderungsgeschwindigkeit der Proteine verhält sich dabei annähernd umgekehrt proportional zum dekadischen Logarithmus ihres Molekulargewichtes. Das gebräuchlichste SDS-Gelsystem ist das Laemmli-System. Die Proteine werden im Sammelgel zu einer schmalen Bande aufkonzentriert. Für diesen Vorgang sind die im Laufpuffer vorhandene Glycin und Chloridionen verantwortlich. Unterhalb von pH 9 liegt Glycin fast nur als Zwitterion, d.h. in elektrisch neutraler Form vor und seine Mobilität ist gering. Dagegen ist die Mobilität der Chloridionen höher, die Mobilität der Proteinionen liegt dazwischen. Chloridionen wandern schneller zur Anode als Glycin und es entsteht ein lokaler Abfall in der Ionenkonzentration. Dies bewirkt ein Abfall der Leitfähigkeit. Da jedoch der Stromfluss überall gleich groß sein muss, steigt die Spannung und die langsamen Ionen werden beschleunigt. Treten sie dagegen in den Chloridbereich ein, so werden sie verlangsamt. Die Folge ist Konzentration aller Proben im Bereich ihrer Mobilität. Durch eine niedrige Polyacrylamidkonzentration im Sammelgel wird der Molekularsiebeffekt zum größten Teil verhindert. Im Trenngel bilden sich dann aufgrund des höheren pH mehr Glycinanionen. Die Mobilität von Glycin steigt und es überholt die Proteine, welche durch den Molekularsiebeffekt aufgetrennt werden. Es bilden sich feine und scharfe Banden. Die Variante nach Schägger und v. Jagow, die sog. Tricin-SDS-PAGE, ergibt eine weiter verbesserte Auflösung im niedermolekularen Bereich durch die Verwendung von Tricin statt Glycin. Da die Mobilität von Tricin relativ unabhängig vom pH ist, unterscheiden sich Sammel- und Trenngel in diesem System nicht voneinander. Tricin wandert im Sammelgel etwas schneller als Glycin, da Tricin unter den üblichen pH-Bedingungen (pH 6,8 - 8,8) in ionischer Form vorliegt. Dies hat zur Folge, dass sich die Proteine mit niedrigeren Molekulargewichten besser an der Salzfront im Sammelgel anordnen.