Inhaltsangabe:Zusammenfassung: In der vorliegenden Arbeit wurden Fluoreszenz-markierte Arrestin-Varianten hergestellt, die in einem geplanten, auf FRET basierenden Funktionstest für rekombinante renaturierte G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (Glukagon like peptide-1-Rezeptor (GLP-1-Rezeptor) und Parathormon-Rezeptor (PTH-Rezeptor)) eingesetzt werden können. Die in der Literatur beschriebene Expression und Reinigung des Arrestins konnte für die Mutante Arrestin2 (1-382) erfolgreich nachvollzogen werden. Durch eine aufeinander folgende Heparin- und Q-Sepharose-Chromatographie wurde das Protein mit der erwateten Reinheit und Ausbeute gewonnen. Diese Mutante bindet mit hoher Affinität den aktivierten, aber unphosphorylierten Rezeptor. Hierdurch wird der geplante FRET-assay bedeutend vereinfacht, da weder ATP noch eine G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Kinase benötigt werden. Es wurden Reaktionsbedingungen gefunden, die zu einer äquimolaren Markierung des sieben Cystein-Reste enthaltenden Arrestin2 mit einem Fluoreszenzfarbstoff führten, wenngleich es nicht gelang, die Verteilung des Modifikationsgrades zu ermitteln. Durch Auswahl eines geeigneten Stammes und Fermentation bei 10 °C wurden erstmals größere Mengen der Fusionsproteine Arr2-L-EGFP und Arr2-L-EYFP löslich in E.coli exprimiert. Nach anfänglichen Schwierigkeiten bei der Verwendung des etablierten Protokolls und zwischenzeitlichen Reinigungsversuchen mit der hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC) gelang es, diese hydrophoben, zur Aggregation neigenden Proteine durch Abwandlung des etablierten Reinungsprotokolls zu isolieren. Die sehr geringe Ausbeute führte zu der Überlegung, die Reinigung durch Anfügen eines His-tags an beide Fusionsproteine zu erleichtern. Nach der erfolgreichen Klonierung der beiden His-tag-Konstrukte wurden diese in Schüttelkulturen exprimiert und mittels IMAC gereinigt. Die Ausbeute und die Reinheit beider Varianten blieben hinter den Erwartungen zurück. Versuche, diese Parameter durch den Zusatz verschiedener Additive zu verbessern, waren erfolglos. Die Bindungsaktivität des Arrestin2, des AEDANS-markierten Arrestin2 und der beiden Fusionsproteine mit und ohne His-tag wurde durch biomolekulare Interaktionsanalyse (BIACORE) nachgewiesen. Eine eindeutige Bestätigung dieser Messungen durch die Isotherme Titrationskaloriemetrie ITC) gelang aufgrund von Substanzmangel und des hohen KD-Wertes der untersuchten Bindungsreaktion nicht. [...]
Kaufen Sie hier:
Horizontale Tabs
Weitere E-Books zum Thema: Biologie und Genetik - Lehre und Forschung
Sie haben Prüfungspanik und brauchen gedrucktes "Valium"? Dann nutzen Sie den Prüfungs-Trainer in den Tagen vor Ihrem großen Tag als roten Faden oder Notprogramm für die letzten…
Sie haben Prüfungspanik und brauchen gedrucktes "Valium"? Dann nutzen Sie den Prüfungs-Trainer in den Tagen vor Ihrem großen Tag als roten Faden oder Notprogramm für die letzten…
Der Prüfungs-Trainer Biologie der Tiere ist ein kompaktes Repetitorium, das sich - evtl. ergänzt durch eigene Stichwort-Mitschriebe - gut für die Prüfungsvorbereitung eignet. Es ist übersichtlich und…
Das Labor ist Ausgangspunkt für die medizinische, pharmazeutische, chemische und biowissenschaftliche Forschung. Fachwissenschaftliches Englisch ist heute im Labor Voraussetzung für effiziente…
Das Labor ist Ausgangspunkt für die medizinische, pharmazeutische, chemische und biowissenschaftliche Forschung. Fachwissenschaftliches Englisch ist heute im Labor Voraussetzung für effiziente…
Das Labor ist Ausgangspunkt für die medizinische, pharmazeutische, chemische und biowissenschaftliche Forschung. Fachwissenschaftliches Englisch ist heute im Labor Voraussetzung für effiziente…
Der Entschluß, ein Buch über den Ursprung (bzw. die Ursprünge) des - bens zu verfassen, setzt voraus, daß man von diesem wissenschaftlichen 'großen Problem' noch immer fasziniert ist, wenn auch die…
Der Entschluß, ein Buch über den Ursprung (bzw. die Ursprünge) des - bens zu verfassen, setzt voraus, daß man von diesem wissenschaftlichen 'großen Problem' noch immer fasziniert ist, wenn auch die…
Der Entschluß, ein Buch über den Ursprung (bzw. die Ursprünge) des - bens zu verfassen, setzt voraus, daß man von diesem wissenschaftlichen 'großen Problem' noch immer fasziniert ist, wenn auch die…
Der Entschluß, ein Buch über den Ursprung (bzw. die Ursprünge) des - bens zu verfassen, setzt voraus, daß man von diesem wissenschaftlichen 'großen Problem' noch immer fasziniert ist, wenn auch die…
Medizin und Gesundheit Aktuell zu Konzepten, Forschung, Therapie, Diagnostik und Klinik
Seit April 1991 erscheint regelmäßig eine monatliche Fachzeitschrift für den jungen niedergelassenen ...
Baumarkt enthält eine ausführliche jährliche Konjunkturanalyse des deutschen Baumarktes und stellt die wichtigsten Ergebnisse des abgelaufenen Baujahres in vielen Zahlen und Fakten zusammen. Auf ...
Berichte und Neuigkeiten aus den Arbeitsgebieten der Diakonie in Düsseldorf. Gibt es Gebrauchsanweisungen, die einen in die Welt des Glaubens einführen? Nun, natürlich nicht in der Art, wie es ...
Das Hauseigentum. Organ des Landesverbandes Haus & Grund Brandenburg.
Speziell für die neuen Bundesländer, mit regionalem Schwerpunkt Brandenburg. Systematische Grundlagenvermittlung, viele ...
Technische Fachzeitschrift aus der Praxis für die Praxis in allen Bereichen des Handwerks und der Industrie.
“der praktiker“ ist die Fachzeitschrift für alle Bereiche der fügetechnischen ...
Zeitschrift für Vollstreckungs-, Zustellungs- und Kostenrecht
Die Deutsche Gerichtsvollzieher Zeitung (DGVZ) ist eine juristische Fachzeitschrift für das Vollstreckungs-, Zustellungs- und ...
Eishockey NEWS bringt alles über die DEL, die DEL2, die Oberliga sowie die Regionalligen und Informationen über die NHL. Dazu ausführliche Statistiken, Hintergrundberichte, Personalities ...
EUPHORION wurde 1894 gegründet und widmet sich als „Zeitschrift für Literaturgeschichte“ dem gesamten Fachgebiet der deutschen Philologie. Mindestens ein Heft pro Jahrgang ist für die ...
Die Flugzeuge der Bundeswehr, Die F-40 Reihe behandelt das eingesetzte Fluggerät der Bundeswehr seit dem Aufbau von Luftwaffe, Heer und Marine.
Jede Ausgabe befasst sich mit der genaue Entwicklungs- ...
filmdienst.de führt die Tradition der 1947 gegründeten Zeitschrift FILMDIENST im digitalen Zeitalter fort. Wir begleiten seit 1947 Filme in allen ihren Ausprägungen und Erscheinungsformen. ...