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Methoden der Analytik mit Enzymen

2.1 Grundlagen

Enzyme nehmen einen bedeutenden Platz in der analytischen Biochemie ein. Man kennt gegenwärtig mehr als 2500 Enzyme, von denen allerdings nur eine verhältnismäßig kleine Zahl analytisch genutzt wird.

Dabei können sie analytisches Werkzeug oder selbst analytischer Parameter sein. So dient in der medizinischen Diagnostik die Bestimmung von Enzymaktivitäten in biologischen Materialien der Charakterisierung metabolischer Prozesse und der Erkennung bestimmter Erkrankungen (Organschädigungen, die zur Freisetzung von Enzymen führen). Da das Enzymmuster (Art und Menge der in einer Zelle enthaltenen Enzyme) vom organspezifischen Metabolismus bestimmt wird, können anhand der in einer Zellart vorhandenen Enzyme Aussagen über einen normalen oder pathologisch veränderten Zellstoffwechsel getroffen werden. In der Lebensmittelindustrie sind Enzymbestimmungen Bestandteil der Qualitätskontrolle; sie können beispielsweise Auskunft über die Effektivität von Sterilisierung bzw. Pasteurisierung oder über Verunreinigungen geben. In der Biotechnologie werden Enzymbestimmungen zur Kontrolle von Fermentationsprozessen herangezogen. Bei Immunotestverfahren und anderen Affinitätstests werden Enzyme zur Markierung verwendet.

Als Biokatalysatoren sind sie wertvolle analytische Werkzeuge für sensitive und spezifische Bestimmungsmethoden einer großen Zahl von Zielsubstanzen. Die in den letzten Jahrzehnten verfeinerten Verfahren zur Isolierung, Reinigung und Optimierung von Enzymen haben entscheidend zur großen Verbreitung enzymatischer Analysenverfahren beigetragen.

2.1.1 Nomenklatur und Klassifizierung der Enzyme

Ein Enzym kann mit einem systematischen Namen, einem Trivialnamen oder einer Codenummer bezeichnet werden. Der systematische Name eines Enzyms wird aus dem umgesetzten Reaktionspartner und dem Reaktionstyp abgeleitet. Nach Empfehlungen der International Union of Pure and Applied Chemistry (IU-PAC) und der International Union of Biochemistry (1973) wurde eine Enzymklassifikation (Enzyme Classification) geschaffen, die Informationen zur katalysierten Reaktion verschlüsselt. Hier wird jedem Enzym eine aus vier Zahlen bestehende (EC-)Nummer zugewiesen. Diese ergibt sich aus der Zuordnung des Enzyms zu Hauptklassen, Unter- und Subunterklassen und einer speziellen Enzymnummer. Die Zuordnung der Enzyme zu einer der sechs Hauptklassen erfolgt nach der von ihnen katalysierten Reaktion, die Zuordnung zu den Unterklassen nach den umgesetzten Substanzgruppen, während die Subuntergruppierungsnummer Informationen zu spezifischen Substraten oder Coenzymen enthält. Aus praktischen Gründen wird im Allgemeinen nach der Angabe der EC-Nummer eines Enzyms der Trivialname benutzt.

Die sechs Hauptklassen sind:

• Oxidoreduktasen
• Transferasen
• Hydrolasen
• Lyasen
• Isomerasen
• Ligasen.

Nur einige von ihnen werden gegenwärtig für analytische Zwecke genutzt. Nachfolgend sind einige wichtige Reaktionen dargestellt.

Von analytischem Wert sind vor allem:

Beispiel:

oder

Beispiel:

oder

Beispiel:

Beispiel:

Beispiel:

Beispiel:

Beispiel:

Beispiel:

Beispiel:

Die Klassifizierung soll anhand des Enzyms mit dem Trivialnamen Glucoseoxidase (GOD) erläutert werden:

2.1.2 Die Natur der Enzyme

2.1.2.1 Struktur und Zusammensetzung

Die meisten Enzyme sind Proteine. Ihre molare Masse kann ca. 104−2 × 105 Da betragen, der Durchmesser liegt über 2,5 nm.

Die katalytische Aktivität der Enzyme ist an eine präzise Konformation gebunden, die durch die Primärstruktur der Polypeptidkette(n), d.h. durch Anzahl und Sequenz der Aminosäurebausteine determiniert ist. Die Aminosäuren sind über Peptidbindungen miteinander linear verknüpft. Es handelt sich dabei um Carbonsäureamidbindungen zwischen der α-Aminogruppe einer Aminosäure und der Carboxylgruppe einer weiteren Aminosäure. Die Peptidbindung bildet jeweils eine Ebene in der Peptidkette. Teile der Peptidkette liegen durch Wasserstoffbrückenbindungen stabilisiert in α-helikaler oder β-Faltblattstruktur vor (Sekundärstruktur), wobei die Wasserstoffbrückenbindungen bei den helikalen Strukturen innerhalb einer Kette, bei den Faltblattstrukturen stets zwischen meist antiparallelen Ketten bestehen. Die meisten Enzyme sind globuläre Proteine, deren Tertiärstruktur dadurch entsteht, dass sich in wässrigem Milieu apolare und polare Aminosäureseitenketten zu hydrophoben bzw. hydrophilen Bereichen zusammenlagern, wobei im Allgemeinen apolare Reste vorwiegend im Inneren des Moleküls liegen, während die polaren Bereiche des Proteinmoleküls nach außen zeigen. Die Raumstruktur kann zusätzlich durch Disulfidbrücken stabilisiert sein (Abb.2.1). Eine große Zahl von Enzymen besteht aus mehreren (gleichartigen oder verschiedenen) Polypeptidketten (Untereinheiten). Diese lagern sich durch nichtkovalente (hydrophobe und ionische) Wechselwirkungen (manchmal auch durch kovalente, z. B. Disulfidbrückenbindungen) zu Enzymen in ihrer Quartärstruktur zusammen (Abb.2.2).

Trotz dieser stabilisierenden Einflüsse ist die Tertiärstruktur...