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Die Octopindehydrogenase der Pilgermuschel Pecten maximus: Neue Einblicke in die Struktur und den Reaktionsmechanismus

AutorAndre Müller
VerlagCuvillier Verlag
Erscheinungsjahr2007
Seitenanzahl190 Seiten
ISBN9783736921580
FormatPDF
KopierschutzWasserzeichen
GerätePC/MAC/eReader/Tablet
Preis18,90 EUR
Die Octopindehydrogenase gehört zur Familie der Opindehydrogenasen, den terminalen Enzymen der anaeroben Glykolyse in unzähligen Invertebraten. Die ODH katalysiert die reduktive Kondensation von Pyruvat und L-Arginin in Anwesenheit von NADH, wodurch D Octopin entsteht. Nach Aufklärung der Primärstruktur der ODH aus der Pilgermuschel Pecten maximus und heterologer Expression des Enzyms in E. coli sind ausreichende ODH-Mengen für strukturelle Untersuchungen verfügbar (Janßen, 2000). In der vorliegenden Arbeit wurden die Primärstrukturen von drei verschiedenen ODH-Isozymen identifiziert. Es ist jeweils nur der Austausch einer einzelnen Aminosäure für die beobachtete, unterschiedliche Wanderung der Isozyme in der nativen PAGE verantwortlich. Diese so genannten Allozyme unterscheiden sich dabei nicht in ihren kinetischen Eigenschaften. Weiterhin wurden Reinigungsprotokolle für rekombinante ODH mit einer Histidin-Fusion als auch für das rekombinante Enzym ohne Affinitätsmarkierung etabliert bzw. verbessert. Die gereinigte ODH wurde in Kristallisationsversuchen eingesetzt. Es konnten drei Bedingungen identifiziert werden, bei denen sich Protein-Kristalle bildeten. Allerdings wuchsen die Kristalle bevorzugt nur in zwei Dimensionen. Die besten Kristalle wurden röntgenographisch untersucht, waren allerdings für die Datensammlung nicht geeignet, da es sich nicht um Einkristalle handelte. Mögliche Ursachen, z.B. Mikroheterogenitäten der ODH-Präparation, wurden als Grund diskutiert. Durch NMR-spektroskopische Untersuchungen konnte die Bindungsreihenfolge der Substrate auf unkonventionelle Weise bestimmt werden. Zuerst muss das Coenzym NADH an die ODH binden. Es kommt zu einer Konformationsänderung, die eine Bindung von L-Arginin ermöglicht. Durch Bindung von L-Arginin an den ODH-NADH-Komplex ändert sich die Konformation erneut und das Coenzym wird in räumliche Nähe zum Übergangszustand der Reaktion gebracht, auf den ein Hydridion übertragen wird. Die ODH verhindert so, dass durch Bindung von Pyruvat und NADH bereits Laktat entsteht. Durch gerichtete Mutagenese konnten neue Einblicke in den molekularen Reaktionsmechanismus der ODH und die an der Katalyse beteiligten Aminosäuren erhalten werden. Es wurden drei Aminosäuren identifiziert, welche die Aufgabe einer katalytischen Histidin-Aspartat-Arginin Triade in der ODH übernehmen könnten. Die Carboxylgruppe des Pyruvats wird durch Arginin 324 stabilisiert. Histidin 212 fungiert als ein Säure-Base-Katalysator. Neben der korrekten Orientierung des Übergangszustandes überträgt das Histidin ein Proton auf die Carbonylgruppe. Aspartat 329 sorgt für eine ausreichende Azidität des Histidins und ermöglicht so die Protonenübertragung. Aminosäurereste, von denen man vermutete, dass sie für die Substratspezifität verantwortlich sein könnten, wurden ebenfalls durch gerichtete Mutagenese untersucht. Die Substratspezifität der ODH für Aminosäuren konnte jedoch nicht verändert werden. Wahrscheinlich sind die, für die Determinierung der Substratspezifität verantwortlichen Aminosäuren durch eine rationale Herangehensweise ohne vorhandene Kristallstruktur der ODH nicht erfassbar.

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