Herausgegeben von:

Priv. Doz. Dr. Maria Mulisch, geb. 1952 in Braunschweig/Niedersachsen. 1973-1974 Studium der Philosophie in Heidelberg; 1974-1980 Studium der Biologie in Heidelberg; 1983 Promotion; 1993 Habilitation. Forschungsschwerpunkt: Protozoologie. Seit 2001 Wissenschaftliche Leiterin der Zentralen Mikroskopie im Biologiezentrum der CAU Kiel. Arbeitsschwerpunkte: Licht- und elektronenmikroskopische Präparationen Immunlokalisationen und Analysen an biologischen Proben, Duchführung von Lehrveranstaltungen für Studenten und Anwender in den Bereichen Licht- und Elektronenmikroskopie.

Prof. Dr. rer. nat. Dr. med. Ulrich Welsch, geb. 1940 in Neustadt/Holstein. 1960-1966 Studium der Anglistik und Biologie in München und Kiel; 1974-1981Studium der Humanmedizin in Kiel; 1983 Approbation. 1984 Vorstand des Lehrstuhls 2 (Cytologie, Histologie, Mikroskopische Anatomie) an der Anatomischen Anstalt der LMU München. Etwa 350 Originalarbeiten u.a. zu den Themen: Vergleichende Mikroskopische Anatomie der Deuterostomier, mutabiles Bindegewebe, Morphologie der Gymnophionen, Zellbiologie der Milch und der Milchdrüse, apokrine Sekretion in Duftdrüsen der Säugetiere.

Mit Beiträgen von:

• Dr. Erna Aescht ( Oberösterreichisches Landesmuseum, Biologiezentrum, Linz-Dornach )
• Frau Simone Buechl ( Akademie für medizinische Berufe, MTLA Schule, Ulm-Wiblingen )
• Frau Anja Burmester ( Kiel )
• Prof. Dr. Christine Desel ( Botanisches Institut und Botanischer Garten, Christian-Albrechts-Universität Kiel )
• Dr. Christoph Hamers ( Nikon GmbH Geschäftsbereich Mikroskope, Düsseldorf )
• Dr. Guido Jach ( Phytowelt Greentechnologies GmbH, Köln )
• Dr. Manfred Kässens ( Olympus Soft Imaging Solutions, Münster )
• Priv. Doz. Dr. Barbara E. Nixdorf-Bergweiler (Institut für Physiologie, Christian-Albrechts-Universität Kiel )
• Herr Stefan Pfeiffer ( Microscopy Services Dähnhardt, Flintbek )
• Herr Detlef Pütz ( Nikon GmbH Geschäftsbereich Mikroskope, Düsseldorf )
• Herr Bernd Riedelsheimer ( Anatomische Anstalt der Universität München)
• Dr. Frank van den Boom ( Nikon GmbH Geschäftsbereich Mikroskope, Düsseldorf )
• Dr. Rainer Wegerhoff ( Olympus Life and Material Science Europa GmbH, Hamburg )

Kaufen Sie hier:

Horizontale Tabs

Blick ins Buch

Inhaltsverzeichnis

Title Page	3
Copyright Page	4
Autoren	5
Benno Romeis (1888 - 1971)	7
Vorwort der Herausgeber	8
Table of Contents	10
1 Mikroskopische Verfahren	12
1.1 Lichtmikroskopie	12
1.1.1 Die Geschichte des Mikroskops	12
1.1.2 Einführung in die Physik des Lichtes	13
1.1.2.1 Licht	14
1.1.2.2 Brechung, Beugung, Interferenz und Polarisation	14
1.1.2.3 Brechung und Brechungsindex	15
1.1.2.4 Beugung und Interferenz	15
1.1.2.5 Polarisation	15
1.1.3 Die Hauptkomponenten des Mikroskops	15
1.1.4 Wie entsteht die Vergrößerung	17
1.1.5 Die Objektive	18
1.1.5.1 Korrektur der chromatischen Aberration und der Bildwölbung	18
1.1.5.2 Auflösung, Schärfentiefe, Arbeitsabstand	19
1.1.6 Kondensoren für die Durchlichtmikroskopie	21
1.1.7 Grundsätzliche Einstellungen für die Mikroskopie	21
1.1.8 Die Köhlersche Beleuchtung	21
1.1.9 Kontrastmethoden	22
1.1.9.1 Dunkelfeld	22
1.1.9.2 Phasenkontrast	24
1.1.10 Relieferzeugende Kontrastmethoden	26
1.1.10.1 Schrägbeleuchtung	26
1.1.10.2 Modulationskontrast	26
1.1.10.3 Differenzieller Interferenzkontrast (DIC)	27
1.1.11 Stereomikroskopie	29
1.1.12 Fluoreszenzmikroskopie	31
1.1.12.1 Prinzip der Fluoreszenz	31
1.1.12.2 Hauptkomponenten im Fluoreszenzmikroskop	31
1.1.13 Konfokale Mikroskopie	33
1.1.14 Multiphotonenmikroskopie	35
1.1.15 TIRF	35
1.1.16 Luminiszenzmikroskopie	36
1.2 Elektronenmikroskopie	36
1.2.1 Einleitung	36
1.2.1.1 Die Anfänge der Elektronenmikroskopie	36
1.2.1.2 Das Auflösungsvermögen in der Elektronenmikroskopie	37
1.2.2 Transmissionselektronenmikroskopie	37
1.2.2.1 Elektronenstrahlquelle	38
1.2.2.2 Elektromagnetische Linsen	40
1.2.2.3 Strahl-Probe-Wechselwirkungen	40
1.2.2.4 Kontrastarten	41
1.2.2.5 Beobachtung und Aufzeichnung des Bildes	43
1.2.2.6 Probenpräparation	43
1.2.2.7 Analysemethoden	43
1.2.3 Elektronentomografie	43
1.2.4 EFTEM	44
1.2.5 REM und ESEM	45
1.2.5.1 Grundsätzlicher Aufbau und Funktionsweise	45
1.2.5.2 Wechselwirkungen zwischen Elektronenstrahl und Präparat	46
1.2.5.3 Detektion	47
1.2.5.4 Vergrößerung und Auflösungsvermögen	48
1.2.5.5 Anwendungen und Probenpräparation	48
1.2.5.6 ESEM – Rasterelektronenmikroskopie unter Umgebungsbedingungen	48
1.2.6 Rastersondenmikroskopie	49
1.2.6.1 Rastertunnelmikroskopie	49
1.2.6.2 Rasterkraftmikroskopie	49
2 Präparationsmethoden	50
2.1 Mikroskopische Untersuchungen von nativem Material	50
2.1.1 Arbeiten mit Lebendmaterial	50
2.1.1.1 Voraussetzungen für das Arbeiten mit Lebendpräparaten	50
2.1.1.2 Präparationsbeispiele für die Herstellung von Lebendpräparaten	51
2.1.1.2.1 Kulturen, Mikroorganismen und Kleinstlebewesen	51
2.1.1.2.2 Micro-Life-Objektträger für die Untersuchung aquatischer Kleinstlebewesen	51
2.1.1.2.3 Objektträger der Serie „? slide I “für die Beobachtung von Zellkulturen	52
2.1.1.2.4 Pflanzliche Präparate	52
2.1.1.2.5 Hirnschnittpräparate und Gewebekulturen	52
2.1.2 Durchführung von physiologischen Versuchen und Vitalfärbung	53
2.1.2.1 Einteilungen der Vitalfärbung	53
2.1.2.2 Eigenschaften von Vitalfarbstoffe	53
2.1.2.3 Vitalfarbstoffe für die Untersuchung in der Hellfeldmikroskopie	54
2.1.2.3.1 Trypanblau	54
2.1.2.3.2 Alizarin	55
2.1.2.3.3 Janusgrün	55
2.1.2.3.4 Neutralrot	55
2.1.2.4 Vitalfarbstoffe für die Untersuchung in der Fluoreszenzmikroskopie	56
2.1.2.4.1 Trypanblau	56
2.1.2.4.2 Acridinorange	56
2.1.2.4.3 Fluoresceindiacetat – Aufnahme von Tracern über die Plasmamembran	57
2.1.2.4.4 Zellkernfärbung am lebenden Präparat mit Hoechst und DRAQ5	58
2.1.2.4.5 Zellkernfärbung mit DAPI	59
2.1.3 Live-Cell-Imaging	59
2.1.3.1 Videofluoreszenzmikroskopie	60
2.1.3.1.1 Organellenmarker	60
2.1.3.2 Calcium-Imaging	61
2.1.3.3 Weitere Methoden des Live-Cell-Imaging (FLIM, FLIP, FRAP, FCS, TIRFM, FRET und BRET)	62
2.1.3.3.1 Fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM	62
2.1.3.3.2 Fluorescence loss in photobleaching, FLIP und fluorescence recovery after photobleaching, FRAP	62
2.1.3.3.3 Fluorescence correlation spectroscopy, FCS	62
2.1.3.3.4 Total internal reflection fluorescence microscopy, TIRFM	63
2.1.3.3.5 Fluorescence resonance energy transfer, FRET	63
2.1.3.3.6 Bioluminescence resonance energy transfer, BRET	63
2.1.3.4 Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)	63
2.1.3.5 Multi-Spectral-Imaging (MSI)	64
2.1.4 Neuronale Tracer und ihre Anwendungen (Neuronales Tracing)	64
2.1.4.1 Retrograde und anterograde Tracer	65
2.1.4.1.1 Retrograde Tracer	65
2.1.4.1.2 Anterograde Tracer	67
2.1.4.1.3 Tracer, die sowohl anterograd als auch retrograd laufen	67
2.1.4.1.4 Lösen, Haltbarkeit und Lagerung der Tracersubstanzen	67
2.1.4.1.5 Auswahl des Tracers für ein Experiment	67
2.1.4.2 Allgemeiner Ablauf eines Versuchs	67
2.1.4.3 Techniken zur Tracer-Applikation	67
2.1.4.3.1 Kristalline Anwendung	68
2.1.4.3.2 Druckapplikation	68
2.1.4.3.3 Iontophoretische Injektion	69
2.1.4.4 Perfusionskammer für in vitro-Farbstoffapplikationen	71
2.1.4.5 Farbstoffapplikationen in der Interface-Kammer	73
2.1.4.6 Anwendungsbeispiele für Tracer-Applikationen	76
2.1.4.6.1 Fluoro Ruby (FR)	76
2.1.4.6.2 Biotinylierte Dextranamine (BDA)	79
2.1.4.6.3 Choleratoxin B (CtB)	81
2.1.4.6.4 Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin (PHA-L)	83
2.1.4.6.5 Neurobiotin, Biocytin	84
2.1.4.6.6 Carbocyanine (Lucifer Yellow, DiI, DiO, DiA)	87
2.2 Probengewinnung zur mikroskopischen Untersuchung und Präparation	88
2.2.1 Abstrichpräparate	88
2.2.2 Ausstrichpräparate	89
2.2.2.1 Ausstriche von Zellsuspensionen	89
2.2.2.2 Organausstriche	90
2.2.3 Tupf- oder Abklatschpräparate	90
2.2.4 Isolationspräparate (Zupfpräparate)	90
2.2.5 Isolation von Zellen	90
2.2.5.1 Entnahme von adhärenten Zellenaus Zellkulturen	90
2.2.5.2 Anreicherung von Suspensionszellen	91
2.2.5.3 Zellsuspensionen von Epithelien	91
2.2.5.4 Mazerationsmethoden von Zellverbänden	92
2.2.6 Isolation von Gewebeteilen	92
2.2.6.1 Biopsie	93
2.2.6.2 Native Schnitte	93
2.2.6.2.1 Freihandschnitte	93
2.2.6.2.2 Herstellung von Schnitten mit Hilfe des Handmikrotoms	93
2.2.6.2.3 Herstellung von Schnitten mit Hilfe des Vibratoms	94
2.2.6.2.4 Herstellung von Schnitten mit Hilfe des Kryostaten	95
2.2.7 Isolation von Zellkompartimenten und Organellen	95
2.2.8 Trennen und Sortieren von Zellen	95
2.2.8.1 Durchflusscytometrie	95
2.2.8.2 Zelltrennung mit Hilfe paramagnetischer Kügelchen (beads)	96
2.2.9 Lasermikrodissektion	96
2.3 Fixierungen für Licht- und Elektronenmikroskopie	98
2.3.1 Theorie der Fixierung	98
2.3.1.1 Ziel der Fixierung	98
2.3.1.2 Fixierungsverfahren	99
2.3.1.3 Mechanismen der chemischen Fixierung	100
2.3.2 Fixanzien für die Licht- und Elektronenmikroskopie	100
2.3.2.1 Fixanzien für die Histologie	100
2.3.2.1.1 Formalin und formalinhaltige Lösungen	102
2.3.2.1.2 Ethanol und ethanolhaltige Lösungen	102
2.3.2.1.3 Fixierung in kalten Lösungsmitteln	103
2.3.2.1.4 Pikrinsäure und pikrinsäurehaltige Lösungen	103
2.3.2.1.5 Quecksilberchlorid (Sublimat) und sublimathaltige Lösungen	103
2.3.2.1.6 Die HOPE-Fixierung	103
2.3.2.2 Gängige Fixanzien für die Elektronenmikroskopie	107
2.3.2.2.1 Glutaraldehyd (GA)	107
2.3.2.2.2 Formaldehyd (FA)	109
2.3.2.2.3 Fixierungsgemische mit Glutaraldehyd und Formaldehyd	109
2.3.2.2.4 Osmiumtetroxid	109
2.3.2.3 Spezielle Fixierungen	110
2.3.2.3.1 2-Phasen-Fixierung	110
2.3.2.2.2 Alternative Fixanzien für die Immunmarkierung und Enzymlokalisation	110
2.3.3 Fixierungsbedingungen und Anforderungen an die Präparate	110
2.3.3.1 Präparatgröße und Penetration	110
2.3.3.2 Menge und Konzentration des Fixans	110
2.3.3.3 Dauer und Temperatur der Fixierung	110
2.3.3.4 Osmolarität und Ionenzusammensetzung	110
2.3.3.5 pH, Puffer und Pufferzusätze	111
2.3.4 Praxis der Fixierung für die Lichtmikroskopie	111
2.3.4.1 Fixierungsartefakte und Abhilfemöglichkeiten	112
2.3.5 Praxis der Fixierung für die Elektronenmikroskopie	112
2.3.6 Fixierungsartefakte und Abhilfemöglichkeiten	113
2.3.7 Beispielhafte Anleitungen	114
2.3.7.1 Behandlung von Zellen und Suspensionen	114
2.3.7.2 Fixierungen für die Cytodiagnostik	114
2.3.7.2.1 Trockenfixierung	114
2.3.7.2.2 Feuchtfixierung	114
2.3.7.2.3 Hitzefixierung (Fixierung vonBakterien)	115
2.3.7.3 Fixierungen für die Elektronenmikroskopie	115
2.3.7.3.1 Fixierungen von menschlichen oder tierischen Gewebeproben	115
2.3.7.3.2 Fixierung von Pflanzenmaterial	115
2.3.7.3.3 Fixierung von Meerwasserorganismen	115
2.3.8 Aufbewahrung fixierten Materials	115
2.3.9 Fixierungs- und Einbettautomaten	115
2.4 Schnittpräparation	116
2.4.1 Schnittpräparation für die Lichtmikroskopie	116
2.4.1.1 Einbettung	116
2.4.1.1.1 Allgemeines	116
2.4.1.1.2 Auswaschen des Fixierungsmittels aus den Präparaten	116
2.4.1.1.3 Entwässern der Präparate	117
2.4.1.1.4 Einbringen der Präparate in ein Intermedium (Zwischenflüssigkeit)	119
2.4.1.1.5 Durchtränken der Präparate mit dem Einbettmittel	119
2.4.1.1.6 Ausgießen (in Blöcke gießen) der Präparate im Einbettmittel	119
2.4.1.1.7 Aushärten der Blöcke	121
2.4.1.2 Einbettzubehör	121
2.4.1.2.1 Zubehör für die Einbettung von Hand	121
2.4.1.2.2 Einbettautomaten	121
2.4.1.2.3 Paraffinspender/Ausgießstation	122
2.4.1.3 Einbettprotokolle	122
2.4.1.3.1 Paraffineinbettung	122
2.4.1.3.2 Kunststoffeinbettung	126
2.4.1.3.3 Celloidineinbettung	128
2.4.1.3.4 Einbettung in Celloidin-Paraffin	131
2.4.1.3.5 Agareinbettung	131
2.4.1.4 Mikrotome und Mikrotomie	131
2.4.1.4.1 Allgemein	131
2.4.1.4.2 Messer in der Paraffinmikrotomie	132
2.4.1.4.3 Spezialmesser	133
2.4.1.4.4 Stellung des Mikrotommessers beim Paraffinschneiden	133
2.4.1.4.5 Mikrotomtypen	134
2.4.1.4.6 Schneidetechnik am Mikrotom	135
2.4.1.5 Leitfaden zur Beurteilung der Präparation	136
2.4.1.5.1 Probleme und Artefakte bei der Schnittpräparation und ihre Abhilfe	136
2.4.1.5.2 Beurteilung von Artefakten im Präparat	136
2.4.2 Schnittpräparation für die Elektronenmikroskopie	138
2.4.2.1 Entwässern und Einbetten für die Ultradünnschnitttechnik	138
2.4.2.1.1 Waschen	138
2.4.2.1.2 Entwässerung	138
2.4.2.1.3 Einbettung von Gewebeproben	139
2.4.2.1.4 Einbettung von Suspensionszellen, kleinen Gewebeteilen oder -schnitten	142
2.4.2.1.5 Einbettung und Schnittvorbereitung von Aufwuchspräparaten	143
2.4.2.1.6 Orientierte Einbettung, Umbettung und Umorientierung von Präparaten	143
2.4.2.1.7 Umbettung von Paraffineinbettungen	145
2.4.2.1.8 Häufige Probleme durch Fehler bei der Entwässerung und Einbettung und mögliche Abhilfe	145
2.4.2.2 Ultramikrotomie	146
2.4.2.2.1 Objektträgernetzchen (Grids)	146
2.4.2.2.2 Glas- und Diamantmesser	148
2.4.2.2.3 Trimmen	148
2.4.2.2.4 Anfertigen und Auffangen der Schnitte	149
2.4.2.2.5 Probleme bei der Ultramikrotomie und Möglichkeiten der Abhilfe	152
2.5 Präparation für die konventionelle Rasterelektronenmikroskopie (REM)	154
2.5.1 Präparate für die REM	154
2.5.2 Präparationsschritte	154
2.5.2.1 Reinigung	154
2.5.2.2 Freilegen interner Strukturen	155
2.5.2.3 Stabilisierungen	155
2.5.2.4 Abdruckverfahren	156
2.5.2.5 Trocknung	156
2.5.2.5.1 Imprägnierung mit Glycerin	156
2.5.2.5.2 Lufttrocknung	156
2.5.2.5.3 Gefriertrocknung	156
2.5.2.5.4 Kritische-Punkt-Trocknung	156
2.5.2.6 Befestigen der Präparate	157
2.5.2.7 Sputtern	158
2.5.2.7.1 Prinzip des Sputterns	158
2.5.2.7.2 Sputter-Coater	158
2.5.2.7.3 Wahl des Target-Materials	158
2.5.2.7.4 Schichtdicken	159
2.5.2.8 Techniken für stark zerklüftete Objekte oder hohe Auflösung	159
2.5.2.8.1 Imprägnierung mit OsO4	159
2.5.2.8.2 Abdecken mit Aluminiumfolie	159
2.5.2.9 Aufbewahrung der Präparate	159
2.5.3 Artefakte	159
2.6 Kontrastierungstechniken für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)	160
2.6.1 Einführung	160
2.6.2 Negativkontrastierung	160
2.6.2.1 Kontrastierungslösungen	160
2.6.2.1.1 Phosphorwolframat (PW)	160
2.6.2.1.2 Uranylacetat (UA)	161
2.6.2.2 Vorgehensweise	161
2.6.2.2.1 1-Schritt-Methode	161
2.6.2.2.2 2-Schritt-Methode	161
2.6.2.3 Probleme und Problemlösungen	162
2.6.3 Bedampfung	163
2.6.4 Positive Kontrastierungstechniken	163
2.6.4.1 Generelle Kontrastierungen	164
2.6.4.1.1 en bloc-Kontrastierung	164
2.6.4.1.2 Schnittkontrastierung	164
2.6.4.1.3 Schnittkontamination durch die Kontrastierung und mögliche Abhilfen	165
2.6.4.2 Spezifische Nachweise	165
2.6.4.2.1 Nachweis von Ionen	165
2.6.4.2.2 Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)	166
2.6.4.2.3 Nachweis von Zuckern	166
2.7 Kryopräparation für die Licht- und Elektronenmikroskopie	168
2.7.1 Kryopräparationstechniken für die Lichtmikroskopie	168
2.7.1.1 Einfrieren der Probe	168
2.7.1.1.1 Einfrieren mit Isopentan	169
2.7.1.1.2 Einfrieren mit CO2	169
2.7.1.1.3 Aufkleben und langsames Einfrieren	169
2.7.1.2 Kryostatschnitte	170
2.7.1.2.1 Herstellen von Kryostatschnitten	170
2.7.2 Kryopräparationen für die Elektronenmikroskopie	171
2.7.2.1 Kryofixierung	171
2.7.2.1.1 Einfrieren bei Umgebungsdruck	172
2.7.2.1.2 Einfrieren unter hohem Druck (Hochdruckgefrierfixierung)	174
2.7.2.2 Entwässerung bei tiefen Temperaturen	178
2.7.2.2.1 Entwässerung bei 0–4 °C	178
2.7.2.2.2 Progressive lowering of temperature-(PLT-)Entwässerung	179
2.7.2.2.3 Gefriersubstitution	179
2.7.2.3 Gefrierbruch- und Replikatechnik	180
2.7.2.3.1 Vorbereitung der Gefrierbrucheinrichtung	180
2.7.2.3.2 Transfer der Probe in die Gefrierbruchanlage	182
2.7.2.3.3 Gefrierbruch	182
2.7.2.3.4 Gefrierätzung	183
2.7.2.3.5 Replizieren der Bruchoberfläche	183
2.7.2.3.6 Abschwimmen der Replika und Replikareinigung	184
2.7.2.4 Kryoschneiden	184
2.7.2.4.1 Kryoschneiden von gefriergeschützten Proben	185
2.7.2.4.2 Kryoschneiden von nicht gefriergeschützten Proben	185
2.8 Literatur	185
3 Färbungen	191
3.1 Allgemeines zur Färbung	191
3.2 Farbstoffe	191
3.2.1 Der sichtbare Anteil des Spektrums, Farben und Licht siehe Kapitel 1.1.2	191
3.2.2 Klassifizierung von Farbstoffen	191
3.2.3 Wichtige Farbstoffe	192
3.2.4 Ladung der Farbstoffe	192
3.2.5 Kennzeichnung von Farbstoffen	194
3.2.6 Färbevokabular	194
3.2.7 Färbetheorien	195
3.2.7.1 Chemische Färbungen	196
3.2.7.2 Physikalische Färbungen	196
3.2.7.3 Physiko-chemische Färbungen	196
3.2.7.4 Theorie der indirekten Färbungen (Beizen)	196
3.3 Herstellen der Farblösungen	197
3.4 Färbezubehör	197
3.4.1 Färbeküvetten	197
3.4.2 Färbebänke, Tropfflaschen und sonstiges Zubehör	197
3.4.3 Färbeautomaten	198
3.4.3.1 Färbeautomat „Karussell“	198
3.4.3.2 Linearfärbeautomat	198
3.4.3.3 programmierbarer Universalfärbeautomat	198
3.5 Behandlung der Schnitte vor und nach dem Färben	199
3.5.1 Montage der Schnitte auf Objektträger und Trocknung	199
3.5.1.1 Objektträger	199
3.5.1.2 Schnittmontage und Trocknung	199
3.5.1.3 Beschichtungsmöglichkeiten der Objektträger	200
3.5.1.3.1 Eiweißglycerin	200
3.5.1.3.2 Chromalaungelatine	200
3.5.1.3.3 Poly-L-Lysin	200
3.5.1.3.4 Silanisierung	201
3.5.2 Behandlung der Schnitte unmittelbar vor der Färbung	201
3.5.2.1 Paraffinschnitte	201
3.5.2.2 Gefrierschnitte	201
3.5.2.3 Kunststoffschnitte	201
3.5.2.4 Fixierungsniederschläge und deren Entfernung	202
3.5.3 Behandlung der Schnitte nach der Färbung	203
3.5.3.1 Nachbehandlung und Fixieren der Färbung	203
3.5.3.2 Einschließen der Präparate	203
3.5.3.2.1 Einschlussmittel für wasserfreie Präparate	204
3.5.3.2.2 Einschlussmittel für wasserhaltige Präparate	205
3.5.3.2.3 Umranden der Präparate	207
3.5.3.3 Erneutes Eindecken/Reparatur	207
3.5.3.4 Behandlung verblasster Präparate	207
3.6 Färbemethoden	208
3.6.1 Kernfarbstoffe und Kernfärbungen	209
3.6.1.1 Hämatoxylin	209
3.6.1.1.1 Hämatoxylin und Hämatein	209
3.6.1.2 Hämatoxylinlacke	209
3.6.1.3 Hämalaune	209
3.6.1.3.1 Saures Hämalaun n. Mayer (1920)	210
3.6.1.3.2 Hämalaun n. Harris (1900)	211
3.6.1.3.3 Hämalaun n. Delafield (1885)	211
3.6.1.3.4 Saures Hämalaun n. Ehrlich (1886)	212
3.6.1.4 Färben mit Hämalaunlösungen	212
3.6.1.5 Eisenhämatoxyline	213
3.6.1.6 Weitere Kernfärbungen	214
3.6.2 Cytoplasmafarbstoffe und Cytoplasmafärbungen	215
3.6.3 Fluoreszenzfarbstoffe	217
3.6.3.1 Acridinorange	217
3.6.3.2 Coriphosphin O	217
3.6.3.3 Auramin-Rhodamin	217
3.6.4 Pigmente	217
3.6.4.1 Allgemeines	217
3.6.4.2 Löslichkeit der Pigmente in Säuren und Laugen	218
3.6.4.3 Bleichen der Pigmente mit H2O2	218
3.6.4.4 Nachweis/Verhalten einzelner Pigmente	219
3.6.4.4.1 Argentaffine Reaktion	219
3.6.4.4.2 Hämosiderin (Siderin)	220
3.6.4.4.3 Hämatoidin	220
3.6.4.4.4 Malariapigment	220
3.6.4.4.5 Lipofuszin (Chromolipoid)	220
3.6.4.4.6 Melanin	220
3.6.4.4.7 Exogene Pigmente	220
3.6.5 Basophilie	220
3.6.6 Metachromasie	221
3.6.7 Übersichtsfärbungen	223
3.6.8 Schnellfärbungen	225
3.6.9 Bindegewebsfärbungen	225
3.6.9.1 Trichromfärbungen	225
3.6.9.2 Darstellung von elastischen Bindegewebsfasern	229
3.6.9.2.1 Komponenten des elastischen Fasersystems	229
3.6.9.2.2 Färbung von Mikrofibrillen der elastischen Fasern und Oxytalanfasern	230
3.6.9.3 Darstellung von retikulären Bindegewebsfasern	233
3.6.10 Stoffnachweise	236
3.6.10.1 Kohlenhydrate	236
3.6.10.1.1 Alcianblaufärbungen	238
3.6.10.1.2 Enzymverdauung	240
3.6.10.1.3 Glykogen	241
3.6.10.1.4 Nachweis von Kohlenhydraten und Glykokonjugaten mit Hilfe von Lektinen	243
3.6.10.2 Amyloid	245
3.6.10.3 Fibrin	247
3.6.10.4 Lipide	247
3.6.10.5 Eisen	249
3.6.10.6 Calciumsalze (Kalk)	251
3.6.10.7 Proteine	252
3.6.11 Nachweis von DNA (Desoxyribonucleinsäure)	252
3.6.12 Darstellung von Bakterien, Pilzen, und Protozoen im histologischen Schnitt	253
3.6.13 Darstellung von Blutzellen im histologischen Schnitt	258
3.6.14 Darstellung des Nervengewebes	260
3.6.14.1 Färbung von Kern- und Nissl-Substanz	260
3.6.14.2 Darstellung von Nerven- und Gliazellen einschließlich ihrer Fortsätze	261
3.6.14.3 Darstellung von Neurofibrillen mit Silberimprägnationsverfahren	266
3.6.14.4 Darstellung der Markscheiden (Myelinscheiden)	270
3.6.14.5 Darstellung degenerierender markhaltiger Nervenfasern	274
3.6.14.6 Darstellung peripherer markhaltiger Nervenfasern	275
3.6.14.6.1 Osmierung	275
3.6.14.6.2 Darstellung der Axone peripherer Nerven	276
3.6.14.7 Darstellung von Gliazellen	276
3.6.14.8 Immunhistologische Nachweise des Nervengewebes	277
3.6.15 Färbungen an Kunststoffschnitten	277
3.6.15.1 Allgemeines	277
3.6.15.2 Entfernen des Kunststoffs (entplasten) aus dem Gewebeschnitt	278
3.6.15.3 Färben ohne Entfernen des Kunststoffs aus dem Schnitt	278
3.6.16 Stückfärbung	279
3.6.17 Medizinische Cytodiagnostik	280
3.6.17.1 Allgemeines und Zellentnahmeverfahren	280
3.6.17.2 Präparateherstellung	281
3.6.17.2.1 Abstrichpräparate von Schleimhäuten	281
3.6.17.2.2 Tupfpräparate	281
3.6.17.2.3 Organausstriche	281
3.6.17.2.4 Blutausstriche	281
3.6.17.2.5 Ausstriche von Flüssigkeiten oder Sekreten	282
3.6.17.2.6 Knochenmarkausstriche/ Quetschpräparate	282
3.6.17.2.7 Ausstriche von Feinnadelaspirationsmaterial	282
3.6.17.3 Fixierung	282
3.6.17.3.1 Trockenfixierung	283
3.6.17.3.2 Feuchtfixierung	283
3.6.17.3.3 Hitzefixierung (Fixierung vonBakterien)	283
3.6.17.4 Färbemethoden	283
3.6.17.4.1 Alternative Färbemethoden	286
3.7 Artefakte	291
3.8 Herstellen mikroskopischer Injektions- und Korrosionspräparate	292
3.8.1 Injektionspräparate	292
3.8.1.1 Tuscheinjektion	292
3.8.1.2 Gelatineinjektionen	292
3.8.1.3 Kautschukinjektion	294
3.8.2 Korrosionspräparate	294
3.9 Einsatz der Polarisationsmikroskopie für die medizinische Diagnostik	296
3.9.1 Grundlagen der Polarisationsmikroskopie	297
3.9.2 Topo-optische Reaktionen	298
3.9.2.1 Die Bedeutung der durch Kongorotfärbung verursachten Anisotropie in der Histologie	298
3.9.2.2 Metachromasie als inverse topo-optische Färbungsreaktion (Toluidinblau-Präzipitations-Methode nach Romhányi 1963)	299
3.9.2.3 Aldehyd-Bisulfit -Toluidinblau-(ABT)-Rektion, Permanganat-Toluidin-blau- (PBT)-Reaktion und Sialinsäurespezifische topo-optische Reaktion	301
3.10 Literatur	303
4 Präparationstechniken und Färbungen von speziellen Geweben	308
4.1 Präparation spezieller Gewebe	308
4.1.1 Paraffineinbettung von großen Objekten	308
4.1.2 Bearbeitung (Fixierung, Einbettung und z.T. Färbung) spezieller Organe	309
4.1.2.1 Zentralnervensystem	309
4.1.2.2 Sinnesorgane	310
4.1.2.2.3 Geruchrorgan	312
4.1.2.3 Respirationstrakt	312
4.1.2.4 Haut	313
4.1.2.4.1 Epidermis	313
4.1.2.4.2 Spezielle harte Differenzierungen der Epidermis	313
4.1.2.5 Geschlechtsorgane	314
4.1.2.5.1 Weibliche Geschlechtsorgane, Eizellen	314
4.1.2.5.2 Männliche Geschlechtsorgane, Spermien	314
4.1.2.6 Embryologische Präparate	316
4.1.2.6.1 Vögel	316
4.1.2.6.2 Säugetiere	317
4.1.2.6.3 Säugetiere: Präparieren jüngster Entwicklungsstadien	318
4.1.2.6.4 Säugetiere: Präparieren älterer Entwicklungsstadien	318
4.2 Präparation von Hartgewebe für die Histologie	318
4.2.1 Allgemeines	318
4.2.2 Präparationsmöglichkeiten	319
4.2.3 Fixierung von Hartgewebe	319
4.2.3.1 Allgemeines	319
4.2.3.2 Fixierflüssigkeiten im Detail	320
4.2.3.2.1 Ethanol	320
4.2.3.2.2 Formollösungen	320
4.2.3.2.3 Formol-Alkohol-Gemische	320
4.2.4 Entkalkung	320
4.2.4.1 Entkalkungsprinzipien	321
4.2.4.1.1 Entkalkungstechnik	321
4.2.4.2 Entkalkungszeit	321
4.2.4.3 Beschleunigungsverfahren	322
4.2.4.3.1 Ultraschallentkalkung	322
4.2.4.3.2 Elektrolytische Entkalkung	322
4.2.4.4 Entkalkungsnachbehandlung	322
4.2.4.5 Entkalkungsmedien	322
4.2.4.5.1 Salpetersäure	322
4.2.4.5.2 Trichloressigsäure	323
4.2.4.5.3 Ameisensäure	323
4.2.4.5.4 Pikrinsäure	323
4.2.4.5.5 Zitronensäure	323
4.2.4.5.6 Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat (EDTA)	323
4.2.4.5.7 Schnellentkalkungsmedien	323
4.2.5 Kunststoffeinbettung	323
4.2.5.1 Allgemeines	323
4.2.5.2 Trenn-Dünnschnitt-Technik	324
4.2.5.3 Trenn-Dünnschliff-Technik	324
4.2.5.4 Darstellungstechniken für Trenn-Dünnschnitte oder Trenn-Dünnschliffe	324
4.2.6 Schliffherstellung ohne Vorbehandlung	324
4.2.6.1 Handschleiftechnik	324
4.2.6.2 Maschinelle Schleiftechnik	325
4.2.7 Mazeration von Skelettteilen	325
4.3 Literatur	325
5 Präparationstechniken und Färbungen von Pflanzengewebefür die Lichtmikroskopie	326
5.1 Einführung	326
5.2 Mikroskopische Technik = Mikrotechnik	326
5.2.1 Vorbereitung des Untersuchungsmaterials	326
5.2.2 Wahl des Präparates	326
5.2.3 Fixierung	327
5.2.3.1 Zustand des zu fixierenden Objektes	327
5.2.3.2 Objektgröße	327
5.2.3.3 Lufthaltige Objekte	327
5.2.3.4 Objekte mit schlecht benetzbaren Oberflächen	328
5.2.3.5 Dauer der Fixierung	328
5.2.4 Fixierflüssigkeiten	328
5.2.4.1 Ethanol	328
5.2.4.2 Formol	328
5.2.4.3 Ethanol-Eisessig-Gemische	328
5.2.4.4 Alkohol-Formalin-Eisessig (AFE)	329
5.3 Weiterverarbeitung des fixierten Materials	329
5.3.1 Konservierung	329
5.3.1.1 Konservierungsgemisch nach Strasburger	329
5.3.2 Mazeration	329
5.3.2.1 Natürliche Mazeration	329
5.3.2.2 Physikalische und chemische Mazeration	329
5.4 Herstellen von lichtmikroskopischen Präparaten	330
5.4.1 Basismaterialien zur Herstellung mikroskopischer Präparate	330
5.4.2 Schnitttechnik	330
5.4.2.1 Handschnitte	330
5.4.2.2 Handmikrotome	331
5.4.2.3 Schlittenmikrotome	331
5.4.3 Weiterverarbeitung des Schnittes zu einem lichtmikroskopischen Präparat	332
5.4.3.1 Aufhellung des Präparates	332
5.4.3.2 Färbemethoden	332
5.4.3.3 Färbung der Präparate	333
5.5 Ausgewählte Färbevorschriften	333
5.6 Hämatoxylinlösungen	339
5.7 Einschlussmittel für Dauerpräparate	345
5.7.1 Wasserlösliche Einschlussmedien	345
5.7.1.1 Glycerin	345
5.7.1.2 Glyceringelatine	345
5.7.1.3 Hydromatrix	345
5.7.2 Wasserunlösliche Einschlussmittel	346
5.7.2.1 Euparal	346
5.7.2.2 Eukitt	346
5.7.2.3 Malinol	346
5.8 Literatur	346
6 Präparationstechniken und Färbungen von Protozoen und Wirbellosen für die Lichtmikroskopie	348
6.1 Einführung	348
6.2 Besonderheiten der Untersuchung	348
6.2.1 Bedeutung der Lebendbeobachtung	351
6.2.2 Herabsetzen der Beweglichkeit von Mikroorganismen	351
6.2.3 Vital- und Supravitalfärbungen	351
6.2.4 Betäubung	352
6.2.5 Vorfixierung („Räucherungsmethoden“)	352
6.2.6 Fixieren	356
6.2.7 Vorbehandlung von Weich-und Hartsubstanzen	359
6.2.8 Bemerkungen zu den Organismengruppen	360
6.2.8.1 Protozoen, heterotrophe eukaryotische Einzeller	360
6.2.8.2 Evertebrata, Wirbellose	364
6.3 Literatur	369
7 Cytogenetik	371
7.1 Allgemeines	371
7.2 Chromosomenspreitung	372
7.3 Chromosomenfärbungen	372
7.3.1 Färbung mit Milchsäure-Orcein	372
7.3.2 Q-Bänderung mit Quinacrin	373
7.3.3 Q-Bänderung mit Hoechst 33258	373
7.3.4 Distamycin A/DAPI-(DA/DAPI-) Färbung	374
7.3.5 C-Bänderung mit Giemsa-Färbung	374
7.3.6 G-Bänderung mit Giemsa-Färbung	374
7.4 Fluorochromierung	375
7.5 Histonnachweis	375
7.5.1 Fast Green FCF für Histone	375
7.5.2 Dansylchlorid	375
7.6 Extraktionsmethoden für Nucleinsäuren	376
7.6.1 Säureextraktion	376
7.6.1.1 Perchlorsäure (HCIO4)	376
7.6.1.2 Trichloressigsäure 5–10 % (CCl3 COOH)	376
7.6.1.3 Pikrinsäure	376
7.6.2 Enzymatische Extraktion	376
7.7 Literatur	376
8 Enzymhistochemie	378
8.1 Allgemeines	378
8.1.1 Gewebevorbehandlung	378
8.1.1.1 Fixierung	378
8.1.1.2 Einfrieren von Gewebe, Kryostatschnitte (Kap. 2.7.1)	379
8.1.1.3 Inkubationsmedien	379
8.2 Ausgewählte Methoden von Enzymnachweisen	380
8.2.1 Phosphatasen	380
8.2.1.1 Alkalische Phosphatase	380
8.2.1.2 Saure Phosphatase	382
8.2.1.3 Glukose-6-Phosphatase	383
8.2.1.4 Adenosintriphosphatasen (ATPasen)	384
8.2.2 Carboxylesterhydrolasen	385
8.2.2.1 Unspezifische Esterasen	385
8.2.2.2 Cholinesterasen	385
8.2.3 Oxidasen, Peroxidasen	387
8.2.3.1 Cytochrom-C-Oxidase	387
8.2.3.2 Peroxidase	387
8.2.3.3 Katalase	388
8.2.4 Dehydrogenasen	389
8.2.4.1 Bernsteinsäuredehydrogenase (Succinatdehydrogenase)	389
8.2.4.2 Tetrazoliumreduktasen	390
8.2.5 Transferasen	390
8.2.5.1 Glykogenphosphorylase (nach C. Sewry)	390
8.2.6 Lyasen	391
8.2.6.1 Carboanhydrase (Carbonat-Dehydratase)	391
8.3 Literatur	392
9 Immunlokalisation	393
9.1 Einführung	393
9.1.1 Grundlagen	393
9.1.2 Aufbau und Eigenschaften von Antikörpern	394
9.1.3 Ähnliche Nachweissysteme	394
9.2 Herkunft, Auswahl, Überprüfung und Reinigung von Antikörpern	395
9.2.1 Herstellung von Antikörpern	395
9.2.2 Reinigung von Antikörpern	398
9.3 Nachweismethoden und Detektion	399
9.3.1 Direkte und indirekte Immunmarkierung	399
9.3.2 Auswahl der Antikörper	400
9.3.3 Indirekte Immunmarkierung über Protein A	400
9.3.4 Signalverstärkung durch die (Strept-)Avidin-Biotin-(ABC-)Technik	401
9.3.5 Lokalisation mehrerer Antigene	401
9.3.6 Detektion	402
9.3.7 Signalverstärkung durch Enzym-Anti-Enzym-Komplex-Techniken	407
9.3.8 Tyraminkatalysierte Signalverstärkung	407
9.4 Anforderungen an die Präparate	408
9.4.1 Whole mount-Immunmarkierung und preembedding-Verfahren	408
9.4.2 Markierung an Schnitten	408
9.4.3 Durchführung der Immunmarkierung	409
9.5 Kontrollen und Problembehandlung	412
9.5.1 Antigendemaskierung	412
9.5.2 Blockierung von Aldehydgruppen	414
9.5.3 Verminderung der Autofluoreszenz	414
9.6 Ausgewählte Anleitungen	415
9.6.1 Affinitätsreinigung von Antikörpern	415
9.6.2 Antigendemaskierung	416
9.6.2.1 Wiederherstellung der Antigenität von Schnittpräparaten für die Lichtmikroskopie nach Fixierung in Formaldehyd und Paraffineinbettung	416
9.6.2.2 Antigendemaskierung für die Immunelektronenmikroskopie	417
9.6.3 Immunhistologische Markierungen	418
9.6.4 Immunmarkierungen für die Elektronenmikroskopie	419
9.6.5 Immunmarkierungen für Licht- und Elektronenmikroskopie	419
9.6.6 Silberverstärkung	420
9.6.7 Reduktion der Autofluoreszenz	420
9.6.8 Herstellung von Einbettmedien für Fluoreszenzpräparate	421
9.7 Literatur	422
10 in situ-Hybridisierung	424
10.1 Einleitung	424
10.1.1 Prinzip	424
10.1.2 DNA:DNA-in-situ-Hybridisierung	425
10.1.3 RNA:RNA-in situ-Hybridisierung	427
10.2 Sonden	428
10.2.1 DNA-Sonden	428
10.2.2 RNA-Sonden	429
10.2.3 Sonden für Bakterien- oder Virussequenzen	430
10.3 Markierung der Sonden	430
10.4 Anforderungen an die Präparate	431
10.5 Präparation von Chromosomen und Zellkernen	431
10.6 Vorbehandlung der Präparate	432
10.7 Denaturierung der Nucleinsäuren	432
10.8 Hybridisierung	432
10.8.1 Spezifität der Hybridisierung	432
10.8.2 Stringenz	433
10.8.3 Verminderung von unspezifischer Hintergrundmarkierung	433
10.8.4 Hybridisierungskinetik	433
10.8.5 Kontrollen	434
10.9 Laborausstattung und Reagenzien	434
10.9.1 Ausstattung	434
10.9.2 Reagenzienqualität und- Handhabung	435
10.10 Arbeitsvorschriften	435
10.11 Probleme und Fehlerquellen	450
10.12 Literatur	452
11 Tissue-Printing	454
11.1 Einführung	454
11.2 Generelle Methodik des Tissue-Printing (geeignet für festes Pflanzengewebe)	454
11.3 Tissue-Prints von zartem Gewebe mit Hilfe von Kryostatschnitten	456
11.4 Nachweise an Tissue-Prints	456
11.4.2 Western-Tissue-Print	457
11.4.3 Northern-Tissue-Print	458
11.4.4 Lokalisation von Enzymaktivität am Tissue-Print	459
11.5 Literatur	460
12 Reporterproteine	461
12.1 Einleitung	461
12.1.1 Enzymatische und lichterzeugende Reporter	461
12.1.2 Chemilumineszenz oder Fluoreszenz?	463
12.1.3 Zur Geschichte der FP	463
12.1.4 Grundlegendes zu fluoreszierenden Proteinen	464
12.2 Fluoreszierende Reporter in der Anwendung	467
12.2.1 Konstruktion geeigneter Expressionsvektoren	467
12.2.1.1 Die Wahl des geeigneten Reportergens	467
12.2.1.2 Wichtige cis-Elemente: Promotoren und Enhancer	467
12.2.1.3 Vektoren für die lokalisierte FP-Expression	468
12.2.2 Transiente und stabile Genexpression	468
12.2.3 Fluoreszenzmikroskopie Analyse	470
12.3 Literatur	472
13 Qualitative und Quantitative Analyse in der Mikroskopie	473
13.1 Einleitung	473
13.2 Erstellung mikroskopischer Bilder	473
13.2.1 Digitale Kameras	473
13.2.2 Erstellung der Helligkeitswerte aus einem mikroskopischen Bild	474
13.2.3 Das Nyquisttheorem	475
13.2.4 Verwendung des adäquaten Kameraadapters	476
13.2.5 Kalibrierung	476
13.2.6 Bildformate und Komprimierung	477
13.3 Bildanalyse	478
13.3.1 Konventionelle Verfahren zur Bildanalyse	478
13.3.1.1 Verwendung eines Okularmikrometers	478
13.3.1.2 Verwendung einer Zählkammer	478
13.3.1.3 Stereologische Messungen	480
13.3.2 Digitale Analyse	480
13.3.2.1 Manuelle digitale Messungen	480
13.3.2.2 Automatisierte Messungen	480
13.3.2.3 Spezielle Verfahren in der digitalen Mikroskopie	480
13.3.2.3.1 Aufnahmen von Panoramabildern	480
13.3.2.3.2 Extended Depth of Focus (EDF)	480
13.3.2.3.3 Dekonvolution	482
13.4 Automatisierte Experimentdurchführung mit motorisierten Mikroskopen	482
13.4.1 Motorische Komponenten	482
13.4.2 Mehrdimensionale Mikroskopie	483
13.4.3 Lebendzellmikroskopie	484
13.5 Ausgewählte Verfahren in der modernen Fluoreszenzmikroskopie	484
13.5.1 Quantifizierung von Fluoreszenzsignalen	484
13.5.1.1 Aufnahme fluoreszenzmikroskopischer Bilder	484
13.5.1.2 Korrekturmechanismen nach der Bildaufnahme	485
13.5.2 Co-Lokalisation	486
13.5.3 Untersuchung der Proteindynamik in lebenden Zellen mit Hilfe fluoreszierender Proteine	486
13.5.4 FRET	488
13.5.5 Quantitative und qualitative Analyse des Fluoreszenzspektrums	490
13.5.6 Quantitative Analyse von Ionenkonzentrationen/Ratio Imaging	491
13.6 Bezugs- und Informationsquellen für Software und Analysemodule	492
13.7 Literatur	493
14 Arbeitsschutz und Sicherheit im histologischen Labor	494
14.1 Einführung	494
14.2 Allgemeines und Grundsätzliches	494
14.3 Sicherheitstechnische Laborausstattung	495
14.4 Notfalleinrichtungen	495
14.5 Persönliche Schutzausrüstung	495
14.6 Hautschutz/Hautschutzplan	496
14.7 Umgang mit Untersuchungsmaterial	496
14.8 Desinfektion	496
14.9 Gefahrstoffe	496
14.9.1 Kennzeichnung von Gefahrstoffen	496
14.9.2 Aufbewahrung, Umgang und Transport von Gefahrstoffen	496
14.9.3 Aufnahmewege von Gefahrstoffen	499
14.9.4 Freisetzung von Gefahrstoffen	499
14.9.5 Gefahrstoffverzeichnis	499
14.9.6 Sicherheitsdatenblätter	499
14.9.7 Betriebsanweisung	499
14.9.8 Unterweisung	501
14.10 Umgang mit Laborabfällen	501
14.11 Umgang mit Mikrotommessern	501
14.12 Brandschutz	501
14.13 Infos zum Arbeitsschutz	502
14.14 Literatur	502
Anhang 1 Tabellen	503
Anhang 2 Aktuelle Bücher zur Mikroskopie	521
Anhang 3 Liste der Anleitungen	524
Index	531